在發(fā)酵工業(yè)中，所有涉及純種培養(yǎng)的發(fā)酵罐均需嚴格滅菌，以防止雜菌污染導致的菌體生長抑制、產(chǎn)物合成受阻或代謝路徑改變。以下是需嚴格滅菌的發(fā)酵罐類型及核心滅菌方法：

一、需嚴格滅菌的發(fā)酵罐類型

1. 好氧發(fā)酵罐  

  - 典型場景：抗生素（青霉素、紅霉素）、氨基酸（谷氨酸）、酶制劑（淀粉酶）發(fā)酵。  

  - 滅菌原因：好氧環(huán)境適合多數(shù)微生物生長，雜菌易通過通氣系統(tǒng)、攪拌軸封等侵入，與生產(chǎn)菌競爭營養(yǎng)和氧氣，甚至分泌降解酶破壞目標產(chǎn)物（如雜菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶可分解青霉素）。  

2. 厭氧發(fā)酵罐  

  - 典型場景：有機酸（乳酸、檸檬酸）、丙酮丁醇、沼氣發(fā)酵。  

  - 滅菌原因：雖為厭氧環(huán)境，但部分雜菌（如產(chǎn)酸菌）在低氧條件下仍可繁殖，消耗底物并產(chǎn)生酸性物質(zhì)，抑制目標菌代謝（如乳酸發(fā)酵中污染大腸桿菌會導致pH下降，乳酸得率降低）。  

3. 基因工程菌發(fā)酵罐  

  - 典型場景：重組蛋白（胰島素、干擾素）、基因工程疫苗生產(chǎn)。  

  - 滅菌關鍵：工程菌常為“營養(yǎng)缺陷型”或攜帶外源質(zhì)粒，雜菌可能通過掠奪營養(yǎng)（如必需氨基酸）或分泌抗生素類物質(zhì)（如細菌素）導致工程菌死亡，甚至引發(fā)外源基因泄漏風險。  

4. 細胞培養(yǎng)罐（動物/植物細胞）  

  - 典型場景：單克隆抗體、病毒疫苗（如新-冠疫-苗）生產(chǎn)。  

  - 滅菌特殊性：動物細胞無細胞壁保護，對雜菌（尤其是支原體、真菌）極其敏感，污染后易引發(fā)細胞凋亡或代謝紊亂，且難以通過后期純化去除。  

二、核心滅菌方法

發(fā)酵罐滅菌需兼顧滅菌徹-底性與設備耐受性，避免高溫、高壓對罐體材質(zhì)（如不銹鋼）、傳感器（如pH電極）或培養(yǎng)基成分（如維生素、氨基酸）的破壞。以下是主要方法：

1. 蒸汽滅菌（SIP，Steam In Place）——最-常用方法  

原理：利用飽和蒸汽的高溫（通常121℃、0.1 MPa，或135℃、0.22 MPa）殺滅微生物（包括芽孢、孢子），通過蒸汽冷凝釋放潛熱實現(xiàn)熱傳導滅菌。  

適用場景：空罐滅菌、培養(yǎng)基連消（連續(xù)滅菌）、管路系統(tǒng)滅菌。  

操作要點：  

- 空罐滅菌：  

 - 關閉所有進料閥，開啟排氣閥，通入蒸汽使罐內(nèi)溫度升至121℃，維持30~60分鐘（根據(jù)罐體容積調(diào)整，如50 m³罐需維持60分鐘）。  

 - 關鍵：確保蒸汽穿透所有角落，避免“死角”（如攪拌軸縫隙、噴嘴背側），可通過熱電偶監(jiān)測罐體不同部位溫度差（應＜1℃）。  

- 實罐滅菌（培養(yǎng)基滅菌）：  

 - 培養(yǎng)基直接裝入發(fā)酵罐，通入蒸汽升溫至121℃，維持20~30分鐘。  

 - 優(yōu)點：操作簡單，無需額外連消設備；缺點：高溫可能破壞熱敏感物質(zhì)（如葡萄糖與氨基酸發(fā)生美拉德反應），可通過“分消”（先滅糖，后滅氮源）優(yōu)化。  

- 連消（連續(xù)滅菌）：  

 - 培養(yǎng)基通過板式換熱器或連消塔，在135℃、3~5分鐘內(nèi)快速滅菌，隨后通入已滅菌的發(fā)酵罐。  

 - 優(yōu)勢：滅菌時間短，營養(yǎng)成分保留率高（如維生素損失比實罐滅菌減少50%），適合大規(guī)模生產(chǎn)。  

設備要求：  

- 罐體需耐受高溫高壓（材質(zhì)為316L不銹鋼，耐壓≥0.3 MPa）；  

- 配置蒸汽進口、排氣口、安全閥及溫度/壓力傳感器，確保滅菌過程可監(jiān)控。

2. 化學滅菌（消毒）——輔助方法  

原理：利用化學試劑的強氧化性或膜損傷作用殺滅微生物，適用于無法耐受高溫的部件或環(huán)境。  

常用試劑：  

- 甲醛熏蒸：  

 - 用于空罐滅菌（尤其是玻璃罐或小型試驗罐），將甲醛溶液（37%~40%）加熱汽化，維持罐內(nèi)甲醛濃度10~15 mg/L，密封12~24小時。  

 - 缺點：甲醛有毒性，需通風換氣48小時以上才能使用，目前逐漸被替代。  

- 過氧乙酸噴霧/擦拭：  

 - 2%過氧乙酸溶液用于罐體內(nèi)部表面消毒，作用15~30分鐘后用無菌水沖洗，適用于局部滅菌（如接種口、取樣閥）。  

- 臭氧滅菌：  

 - 通過臭氧發(fā)生器產(chǎn)生O?氣體，通入罐內(nèi)維持濃度≥60 mg/m³，作用30分鐘以上，適用于潔凈區(qū)環(huán)境或管路系統(tǒng)滅菌（如配液管道）。  

3. 過濾滅菌——針對氣體與液體  

原理：利用微孔濾膜（孔徑≤0.22 μm）截留微生物，適用于無法高溫滅菌的物料（如血清、酶溶液）或通氣系統(tǒng)。  

應用場景：  

- 空氣過濾滅菌（好氧發(fā)酵核心環(huán)節(jié)）：  

 - 壓縮空氣先經(jīng)粗濾（去除塵埃顆粒）、冷卻除水，再通過0.22 μm聚四氟乙烯（PTFE）或尼龍濾膜，確保通入發(fā)酵罐的空氣無菌（理論過濾效率＞99.9999%）。  

- 液體培養(yǎng)基過濾：  

 - 用于熱敏性成分（如維生素C、抗生素溶液），通過深層過濾（如硅藻土過濾）結合膜過濾，例如單克隆抗體生產(chǎn)中，細胞培養(yǎng)液需經(jīng)0.22 μm濾膜除菌后才能進行純化。  

4. 輻射滅菌——特殊場景應用  

原理：利用γ射線（如鈷-60）或β射線的高能粒子破壞微生物DNA，適用于一次性發(fā)酵袋（如50~200 L的Single-Use系統(tǒng)）或塑料配件。  

特點：  

- 無需高溫，對材料兼容性好；  

- 滅菌均勻，但需專業(yè)輻照裝置，成本較高，主要用于生物醫(yī)藥領域。  

三、滅菌效果驗證與關鍵控制點

1. 無菌檢測：  

  - 滅菌后取發(fā)酵液樣本，接種至肉湯培養(yǎng)基，30~37℃培養(yǎng)72小時，觀察是否渾濁（雜菌生長跡象）；  

  - 基因工程發(fā)酵中需增加支原體檢測（如PCR法），確保無隱性污染。  

2. 防止二次污染：  

  - 滅菌后所有操作需在無菌環(huán)境下進行（如接種時使用火焰保護，取樣采用封閉式取樣閥）；  

  - 通氣系統(tǒng)的空氣過濾器需定期更換（通常每批次或每6個月更換，視使用頻率而定），避免濾膜堵塞或破損導致漏菌。  

3. 工藝優(yōu)化：  

  - 對于含固量高的培養(yǎng)基（如淀粉、黃豆餅粉），需延長滅菌時間或提高蒸汽穿透力（如增加攪拌使物料翻動）；  

  - 采用“脈沖式滅菌”（多次短時間蒸汽沖擊）可減少熱敏感物質(zhì)損失，同時保證滅菌效果（如對含糖培養(yǎng)基，121℃滅菌20分鐘分兩次進行，中間自然降溫至100℃以下）。  

發(fā)酵罐滅菌是純種發(fā)酵的“生命線”，其核心邏輯是根據(jù)物料特性與設備條件選擇適宜滅菌組合：  

- 蒸汽滅菌是主流，覆蓋罐體、培養(yǎng)基與管路；  

- 過濾滅菌是通氣系統(tǒng)的“剛需”，確保無菌空氣供應；  

- 化學滅菌與輻射滅菌作為補充，解決高溫敏感場景的需求。  

通過“滅菌方法協(xié)同+過程監(jiān)控嚴格化”，可將雜菌污染概率控制在0.1%以下，保障發(fā)酵過程的穩(wěn)定性與產(chǎn)物質(zhì)量。